1853年，太平军占领南京，清廷下诏各地在籍京官举办团练。冯桂芬与程廷桂等人闻诏而动，参与镇压小刀会起义，因功晋五品衔，1856年擢右春坊右中允，进京任职。后因请江苏巡抚许乃钊行大小户均赋法，遭名公巨卿记恨，借细故奏请开缺，于1859年托病辞官归里。对此，他并不懊丧，曾表示“前者被谤之举，为民为国，开罪于权门势族而不悔”。次年春，冯桂芬于苏州城外赁屋而居，课业授徒，从事教育活动。冯桂芬“性恬淡，服官仅十年，然家居遇事奋发，不避劳怨”。1860年6月，太平军破清江南大营，攻占苏州。江苏抚藩移驻上海县城，江浙地主官绅纷纷逃往上海，于是“上海洋泾之上，新筑室纵横十余里，地值至亩数千金，居民殆百万，商贾辐辏，厘税日旺”。冯桂芬也于此时携带全家老小辗转逃往上海。为保住上海重镇，上海地方官绅拼凑起一支千余人的洋枪队，招募了四五万兵勇。然前者仅足守松江而已，而后者“皆市井无赖，或盗窃或通贼”，皆不可恃。于是官绅商议向坐镇安庆的湘军统帅曾国藩乞请援师，嘱冯桂芬执笔修书。书成，列名者有庞钟璐（内阁中书）、潘曾玮（刑部郎中）、顾文彬（湖北盐道）及殷兆镛、杨庆麟、潘馥等6人，冯桂芬以“不与公事，不列”。送递办法初拟派员赴皖，因人选难觅，又拟邮寄，冯桂芬力争不可，认为邮寄“是轻其事矣，必不可。且余以为此申包胥勃苏之任，宜重其选”。于是荐太仓主事钱鼎铭，“众以为得人，许之”。

    钱鼎铭持援书赴皖，面呈曾国藩，“语次声泪俱下，叩头乞师，情辞哀迫”。冯桂芬所修求援书“陈沪城危状，及用兵机宜，累数千言”。“国藩读之感动”，且念上海是“朝廷膏腴之区”，“人民千万，财货万万，全东南数省不足比其富庶”，遂遣李鸿章招募淮军6000人东下。“既解沪上围，进克苏州，皆辟以为助”。

    淮军到上海前，冯桂芬参与筹设了上海中外会防局，以“调和中外杂处者”。李鸿章到上海后，署理江苏巡抚，开设幕府，广延人才，冯桂芬被聘请襄办营务。冯桂芬学识非常全面，疏浚河道、建立学府、筹集粮谷，样样都有见地，各类文书皆出自他手，是李鸿章幕中的学者型人才。

    时苏南几经战乱，“一望平芜，荆榛塞路”，民人流离，户口大减。冯桂芬“生长地间，深知重赋之苦”，故把“减赋”作为他的宏誓大愿。他曾将所拟“减赋节略”呈曾国藩，得其首肯。此时又“尝从容为鸿章言吴人粮众之苦，往往因催科破家”，李鸿章即请冯桂芬拟稿，6月与曾国藩联衔奏准，“有诏减苏、松、太米赋三之一，常、镇十一，著为令”。同年，冯桂芬又建议李鸿章“设广言方馆，求博通西学之才，储以济变”。不久，冯桂芬受命主持兴建了苏州试院，复建了紫阳书院，改建了正谊书院，并主书院讲席。1867年，他又主持重修了吴县县学。为表彰冯桂芬襄办军务和讲学著述的功绩，清廷赏其四品卿衔，1870年，赏三品衔。但冯桂芬从未再出仕为官。